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  BAC文庫構建的技術資料  
 
BAC文庫構建的技術支持:
 材料

  緩沖液和溶液
   - 堿裂解液I , 4°C
    50 mM 葡萄糖
    25 mM Tris-Cl (pH 8.0) 
    10 mM EDTA (pH 8.0)
    配制堿裂解液I 約100ml,滅菌,保存在四度。
   - 堿裂解液II,新鮮配置,室溫保存
    0.2 N NaOH (從10N的NaOH新鮮制備)
    1% (w/v) SDS 
    堿裂解液II應該新鮮配制,室溫保存。
   - 堿裂解液III, 4°C
    5M 醋酸鉀,60ml
    冰醋酸,11.5ml
    SDW,28.5ml
   - 酒精
   - 70%酒精
   - 異丙醇
   - 酚:氯仿(1:1, v/v)
   - 醋酸鈉 (3M,pH5.2)
   - STE,4°C
    10 mM Tris-Cl (pH 8.0) 
    0.1 M NaCl 
    1 mM EDTA (pH 8.0)
   - TE (pH 8.0) 
    10 mM Tris-Cl (pH 8.0) 
    10 mM EDTA (pH 8.0)
 載體與菌株
    BAC轉化的大腸桿菌
 培養基和抗生素
    含12.5μg/ml氯霉素的LB平板和液體培養基
 酶和緩沖液
    溶菌酶
    RNaseA,不含DNase
    限制性內切酶和相應緩沖液
 核苷酸/寡核苷酸
    用于脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis)的DNA標準參照物
 凝膠/點樣緩沖液
    脈沖場凝膠電泳(Pulsed-field gels,或者0.5%瓊脂糖凝膠)
 離心機/轉頭/離心管
  其他
    37攝氏度搖床
 
1. BAC DNA大量提取方案 (參考文獻:Molecular cloning: A Laboratory Manual Third Edition)
此方案適合從500ml的菌液中提取BAC DNA,一般可以產生20-25μg純化的DNA。
方法
1. 將50μl BAC轉化菌的過夜培養物接種到500ml含12.5μg/ml氯霉素的LB液體培養基中,37℃ 震蕩(280rpm)培養12到16小時。
2. 2500g,4℃,離心15min,收集菌體。
3. 用100ml冰預冷的STE重新懸浮細菌沉淀。按步驟2方法離心收集細菌。
4. 用24ml含RNase(100μg/ml)的堿性裂解液I溶解細菌。加溶菌酶至終濃度為1mg/ml。
5. 加入24ml新鮮配置的堿性裂解液II。蓋緊離心瓶蓋,輕輕翻轉瓶子數次,使內容物完全混勻,冰裕5min。
6. 加入24ml冰預冷的堿性裂解液III,蓋緊瓶蓋,輕輕翻轉瓶子數次,使內容物完全混勻,置冰上5min。
7.15000g,4℃,離心10min,將上清轉移到另一離心瓶中,棄沉淀。
8. 加等體積的酚:氯仿。輕輕翻轉離心瓶數次,混勻。3000g,室溫離心15min。
9. 將水相移至另一離心瓶中,加入等體積的異丙醇,翻轉離心瓶數次,混勻。
10. 15,000g,室溫離心15分鐘,回收核酸沉淀。
11.棄上清,用20ml 70%乙醇漂洗沉淀。
12.棄乙醇,風干使乙醇揮發殆盡。
13.小心將BAC DNA沉淀溶于0.2ml TE (pH8.0) 中。
 2. BAC DNA的小量提取 (參考文獻:Molecular cloning: A Laboratory Manual Third Edition)
此方案適合從5ml菌液中提取BAC DNA,一般可以產生0.1-0.4μg的BAC DNA。
方法:
1.  挑取單菌落接種至5ml含12.5μg/ml氯霉素的LB培養基中,37℃劇烈震搖過夜。
2.  2000g,4℃,離心5min,收集菌體。
3.  在每個離心管中加5ml預冷的STE,用移液器吹懸細菌沉淀。按步驟2離心收集細菌。
4.  將菌體重懸于200ul冰冷的堿性裂解液I中。將菌體轉移至預冷的微量離心管中,置于冰上。
5.  向管中加入400μl新鮮配置的堿性裂解液II。輕輕翻轉數次,將離心管置于冰上。
6.  向管中加入300μl冰冷的堿性裂解液III,輕輕翻轉數次。將離心管置于冰上5min。
7.  在微量離心機上以最大速度4℃離心5min,除去細胞碎片沉淀。將上清移入一新的微量離心管中。室溫下加入900μl異丙醇,輕輕翻轉數次離心管,混勻。
8.  立即在微量離心機上室溫下最大速離心5min,使核酸沉淀。棄去上清,用1ml 70%乙醇小心漂洗。室溫下離心2min,吸去乙醇。室溫干燥沉淀5-10min后,將沉淀溶于50μl TE(pH8.0)中.
 

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